上期舌源类器官中，我们介绍到正常舌源类器官主要有两种，即舌上皮类器官和味蕾类器官，整理了它们的结构及功能特点。本期小恒接着带大家了解舌上皮和味蕾类器官的建立方法。
图1 舌源类器官[1]
1. 舌上皮类器官建立过程[2-4]
1.1 主要实验试剂及材料
（1）主要试剂：螯合缓冲液、Dispase II (50 U/mL)、Matrigel、预冷PBS。
（2）基础培养基：Advanced DMEM/F12。
（3）细胞因子及添加物：EGF，Noggin，R-spondin1，N-2/B-27，N-乙酰半胱氨酸，GlutaMAX，Y-27632（凋亡抑制剂）等。
（4）组织/细胞来源：小鼠舌组织。
展开剩余90%1.2 培养步骤
1.2.1 舌上皮细胞（LEC）分离与收集
（1）取小鼠舌头组织，在冷PBS中清洗后切成约2 mm碎片，随后加入Dispase II，37℃孵育60 min；
（2）用冷PBS洗涤碎片两次，以去除残留的Dispase II；
（3）洗涤后的舌组织碎片转移至4℃的螯合缓冲液中，不断搅拌10 min，通过40 μm孔径的细胞筛网过滤收集释放出的细胞，为第一轮细胞产物（Fraction 1），其中主要为上皮干细胞（LESC）；
（4）再次将组织碎片转移到新鲜的预冷螯合缓冲液中，手动剧烈震荡（上下颠倒混匀20次），此时得到的是第二轮细胞产物（Fraction 2）。
1.2.2 Matrigel制备与细胞接种
（5）针对24孔板，在冰上解冻Matrigel，取200 μL Matrigel与2-4×104个LEC细胞混合均匀，避免产生气泡；
（6）将含有LEC的50 μL Matrigel接种至预热的24孔板中，即每孔0.5-1×104个细胞，室温下固化3-4 min；
（7）凝固后的Matrigel表面覆盖750 μL含生长因子的培养基，并向周围孔中加入蒸馏水以防干燥，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.2.3 舌上皮类器官形成
（8）第0-3天，培养基中同时添加Y-27632，防止LEC细胞凋亡；
（9）第4天起，每2-3天更换一次培养基，加入新鲜培养基500 μL，且不再添加Y-27632；
（10）在第3-4天，可观察到初始细胞团，直径约20-30μm；
（11）在第5-10天，可能形成三类舌上皮类器官：
① 圆形同心圆排列类器官（round-org-with-SCs），含多层角化上皮和角质层，类似丝状乳头结构；
图2 round-org-with-SCs[2]
② 粗糙型类器官（round-org-with-CLs），中央有坏死腔；
图3 round-org-with-CLs[2]
③ 无腔圆形类器官（round-org-w/o-CLs），无角质层。
图4 round-org-w/o-CLs[2]
（12）第14天左右，round-org-with-SCs形成明显的角质层，即成熟的舌上皮类器官。
1.3 舌上皮类器官收集与鉴定
（13）去除培养基，加入0.5-1 mL预热的Dispase II，37℃孵育10 min，使 Matrigel解聚；
（14）用1 mL枪头吹打解聚的Matrigel，以释放类器官，随后转移至15 mL离心管中，4℃、110g离心1 min，弃上清和凝胶，收集类器官；
（15）收集的舌上皮类器官可通过组织切片染色、电镜观察等进行鉴定。
① 对于组织学分析，可用4%多聚甲醛固定后进行冰冻切片或石蜡切片的制备，HE染色可观察到角质层、多层上皮结构；免疫染色可检测到干细胞标志物Keratin 5/14、增殖标志物Ki67。
② 对于电镜观察，通过透射电镜可看到上皮分化特征：角质透明颗粒、角蛋白纤维及桥粒结构。
2. 味蕾类器官建立过程[5-8]
2.1 主要实验试剂及材料
（1）主要试剂：Dispase II、TrypLE Express酶（或含EDTA的胰酶）、胶原酶 A、Matrigel等。
（2）基础培养基：Advanced DMEM/F12。
（3）细胞因子及添加物：R-spondin-1，EGF，Noggin，Jagged-1，N-2/B-27，N-乙酰半胱氨酸等。
（4）组织/细胞来源：小鼠舌部的轮廓乳头或菌状乳头。
2.2 培养步骤
2.2.1 舌上皮分离
（1）解剖小鼠后舌部分，使用DispaseⅡ在37℃孵育25 min，将舌上皮层与下层舌间质分离；
（2）分离出轮廓乳头区域的上皮组织，用TrypLE Express酶消化30 min，800 rpm离心20 min，收集细胞沉淀。
2.2.2 Matrigel嵌入培养（传统方法）
（1）冰上解冻Matrigel后，与细胞沉淀混合均匀，以50 μL/孔接种于24孔板，于37℃培养箱中凝固；
（2）加入预热的、含细胞因子和添加剂的培养基，每2-3天更换一次培养基；
（3）通常7-14天后形成类器官球体。
2.2.3 悬浮培养（改进方法）
（1）同样地，将舌上皮分离得到的细胞沉淀，重悬于解冻的Matrigel中，接种于24孔板，加入生长培养基培养4天；
（2）4天后，去除生长培养基，用预冷基础培养基洗涤，并反复颠倒以破坏Matrigel，4℃条件下900rpm轻柔离心5 min，吸去上清，重复3次；
（3）将类器官重悬于生长培养基，转移至超低吸附96孔板中，于37℃、5% CO2条件中培养；
（4）约14天后，味蕾类器官体积减小，无角质化核心，相比Matrigel嵌入培养，有更多的味蕾细胞定位至外层。
图5 Matrigel和悬浮培养的类器官形态[5]
2.3 味蕾类器官收集与鉴定
（1）可直接从培养基中吸取味蕾类器官，用PBS洗涤后即可用于后续鉴定等实验检测；
（2）味蕾类器官可以从形态学、分子标记和功能三个方面进行鉴定：
① 形态上，Matrigel培养呈大球形，含角质化核心；而悬浮培养的呈小而均匀的球形，无角质化核心，且电镜下可观察到微绒毛朝向外侧。
② 分子标记：可通过qPCR、WB和免疫荧光染色分析，可检测到干细胞标记Lgr5、Sox9、p63等，味蕾细胞标记K8、TRPM5等。
③ 功能鉴定：可用钙离子探针标记味蕾类器官，检测味觉刺激引发的钙离子波动。
图6 不同培养方法的味蕾细胞定位[6]
以上便是小恒为大家整理的舌上皮类器官和味蕾类器官的建立过程与鉴定方法，供大家参考学习。根据研究报道[6]，味蕾类器官培养选择悬浮培养的效果更好，能够使味蕾细胞定位于类器官结构外侧，更接近体内的结构，且便于验证其对于味觉刺激的反应。下期类器官系列，小恒继续为大家介绍口腔粘膜类器官，欢迎大家持续关注~
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参考文献
[1] Sui Y, Zhang S, Li Y, et al. Generation of functional salivary gland tissue from human submandibular gland stem/progenitor cells. Stem Cell Res Ther. 2020;11(1):127. Published 2020 Mar 20.
[2] Hisha H, Tanaka T, Kanno S, et al. Establishment of a novel lingual organoid culture system: generation of organoids having mature keratinized epithelium from adult epithelial stem cells. Sci Rep. 2013;3:3224.
[3] Hisha H, Ueno H. Organoid Culture of Lingual Epithelial Cells in a Three-Dimensional Matrix. Methods Mol Biol. 2019;1576:93-99.
[4] Hisha H, Tanaka T, Ueno H. Lingual Epithelial Stem Cells and Organoid Culture of Them. Int J Mol Sci. 2016;17(2):168.
[5] Adpaikar AA, Zhang S, Kim HY, et al. Fine-tuning of epithelial taste bud organoid to promote functional recapitulation of taste reactivity. Cell Mol Life Sci. 2022;79(4):211.
[6] Ren W, Lewandowski BC, Watson J, et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(46):16401-16406.
[7] Anish Ashok Adpaikar, Jong-Min Lee, Han-Sung Jung. Suspension-cultured taste bud organoids recapitulate in vivo taste buds. Organoid. 2023;3e9.
[8] Liu S, Zhu P, Tian Y, et al. Preparation and application of taste bud organoids in biomedicine towards chemical sensation mechanisms. Biotechnol Bioeng. 2022;119(8):2015-2030.
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